• 1
  • 2
  • 2
  • 13
  • 14
  • 15
  • 16
вернуться на главную

Апробация проекта стандарта ISO/DIS 15553 (EPA-821-R-99-006) по определению ооцист криптоспоридий и цист лямблий в воде

В соответствии с договоренностью с МУП «МОСВОДОКАНАЛ» в 2003г. было проведено апробирование методики паразитологического анализа ISO/DIS 15553 (EPA-821-R-99-006) по обнаружению цист лямблий и ооцист криптоспоридий в пробах воды с применением иммуномагнитного разделения и флюоресцирующих антител.

Работа проводилась в 2 этапа. На первом этапе отрабатывались процедура иммуномагнитного разделения (IMS) модельных проб на водопроводной питьевой воде с применением набора Aureon CG Kit и прямого мечения очищенного концентрата препаратом Aqua-Glo G/C Kit (смесь флюоресцентных моноклональных антител к цистам и ооцистам) и диамидинофенилиндолом (DAPI). Флотация в этой методике заменена на иммуномагнитную сепарацию, позволяющую достигнуть значительно более высокой степени очистки концентрата пробы от фоновых взвесей и перейти за счет этого к прямому иммунофлюо-ресцентному мечению с дополнительным окрашиванием ядер DAPI. Это приводит к значительному сокращению трудозатрат на процедуры мечения и микроскопии пробы.

При иммуномагнитной сепарации в концентрат пробы вносится смесь суспензий парамагнитных частиц, покрытых моноклональными антителами к поверхностным антигенам цист и ооцист. После перемешивания частицы образуют агрегаты с цистами и ооцистами, притягивающиеся к постоянному магниту. Вслед за удалением всех посторонних взвесей при удержании агрегатов частиц и цист на поверхности магнита проводится диссоциация агрегатов соляной кислотой. Благодаря повторному удержанию частиц на поверхности магнита, достигается высокая степень очистки концентрата и уменьшение его объема до 100 микролитров.

Прямое флюоресцентное мечение концентрата пробы производилось на слайдах с лунками диамет-ром 8 или 15 мм с последующим использованием раствора DAPI для мечения ядер.

На втором этапе на реальных пробах отрабатывалась полная схема выполнения анализа, включая два способа концентрирования проб — флокуляцией в 10 л канистрах и фильтрацией на 10-ти дюймовые картриджные фильтры, рекомендованные в предыдущей версии методики EPA/600/R-95/178. Для концентрирования проб был выбран метод флокуляции карбонатом кальция (ISO/DIS 15553). Работа проводилась с применением реальных проб (17), отобранных в параллели с пробами, обрабатываемыми по EPA/600/R-95/ 178. В таблице 1 представлены значения эффективности исполнения по полной схеме от концентрирования до микроскопии методики EPA/600/R-95/178, применявшейся в ЗАО «РОСА» с 1997 по 2003 гг. включительно, и методики ISO/DIS 15553 (EPA-821-R-99-006) с концентрированием флокуляцией или картриджной фильтрацией (полученные значения концентрации цист в этом случае отмечены значком «*»).

Полученные результаты показывают, что методики с применением иммуномагнитной сепарации и двойного флуоресцентного мечения (специфического с моноклональными антителами и неспецифи-ческого с DAPI) являются в среднем на 381% более эффективными, чем методика с очисткой концентрата пробы, основанной на флотации, и одинарным флюоресцентным мечением (EPA/600/R-95/178). Повышение эффективности достигалось в основном не за счет метода концентрирования (фильтрации) пробы, а благодаря иммуномагнитной сепарации концентрата и двойного флюоресцентного мечения, так как эффективность выделения в пробах (№№ 12, 15,16), сконцентрированных на картридже и далее обработанных по ISO/DIS 15553 (EPA-821-R-99-006), составила в среднем 324% от эффективности анализа этих же проб по EPA/600/R-95/178, различающегося именно отсутствием иммуномагнитной сепарации и второго флюоресцентного мечения.

Достоинствами метода ISO/DIS 15553 и EPA-821-R-99-006 являются:

  • высокая эффективность при выделении цист жиардий и ооцист криптоспоридий (в среднем в 4 раза выше, чем при EPA/600/R-95/178),
  • значительное сокращение времени микроскопирования за счет использования слайдов с малень-кими лунками и получения чистых препаратов,
  • сокращение времени на пробоподготовку,
  • возможность сокращения объема проб воды, не прошедшей питьевой водоподготовки, до 10 л.

К сожалению, отечественные экономические условия не позволяют использовать оборудование, рекомендованное ISO/DIS 15553 и EPA-821-R-99-006 для инструментального отбора проб, так как сто-имость капсульных фильтров Envirochek производства Pall Gelman составляет в РФ порядка 100 долла-ров США на 1 пробу, стоимость оборудования для фильтрации через эти фильтры и последующей их элюции равняется 5000 долларов США. Стоимость фильтра Filta-Max производства Idexx Technologies составляет приблизительно 40 долларов США на пробу, стоимость оборудования для промывки 3500 долларов США, стоимость оборудования точки отбора на напорной линии для использования данного капсульного фильтра в Великобритании равняется 10000 фунтов стерлингов.

Во введении метода 1623 (EPA-821-R-99-006) указывается, что «допускаются альтернативные техники, при соответствии всем допустимым критериям контроля качества данного метода». В разделе 21.0 метода 1623 (Таблица 1) приведены допустимые эффективности (восстановления) для криптоспоридий и лямблий, укладывающиеся в диапазон 19 — 100% и 16 — 100% соответственно. Проведенные в течение 2003 года в ОБМА испытания с модельными пробами с внесением цист и ооцист, концентрированием модельных проб флокуляцией с карбонатом кальция (ISO/DIS 15553) или картриджной фильтрацией на 10-ти дюймовый фильтр и последующей иммуномагнитной сепарацией и иммунофлюоресцентным мечением в строгом соответствии с процедурами ISO/DIS 15553 и EPA-821-R-99-006, показали эффективность модификации методики с картриджной фильтрацией в диапазоне 20-40%, то есть допустимом согласно EPA-821-R-99-006.